9月6日，首個(gè)國家亞健康干預(yù)技術(shù)成果應(yīng)用中心落戶長沙麓谷,國家中醫(yī)藥管理局亞健康干預(yù)技術(shù)實(shí)驗(yàn)室隸屬于國家中醫(yī)藥管理局，是國內(nèi)唯一從事亞健康干預(yù)技術(shù)研究的專業(yè)機(jī)構(gòu)，擁有以國家973項(xiàng)目主持人、教育部新世紀(jì)優(yōu)秀人才為核心的研究團(tuán)隊(duì)，專業(yè)從事亞健康干預(yù)技術(shù)的研究。2012年9月，該實(shí)驗(yàn)室主任劉東波教授當(dāng)選為聯(lián)合國亞太亞健康干預(yù)技術(shù)聯(lián)盟主席，以“未病防病、既病防變、愈后防復(fù)”為目標(biāo)，對慢性非傳染性疾病提出心理、行為、膳食和營養(yǎng)干預(yù)方案，并于2016年成立了國家中醫(yī)藥管理局亞健康干預(yù)技術(shù)實(shí)驗(yàn)室糖尿病干預(yù)中心。糖尿病作為實(shí)驗(yàn)室創(chuàng)立后的一個(gè)重要的慢性病研究對象，歷經(jīng)長期研究，獨(dú)創(chuàng)了國內(nèi)第一套糖尿病中醫(yī)營養(yǎng)干預(yù)技術(shù)。

劉東波教授文獻(xiàn)當(dāng)中分享了國家中醫(yī)藥管理局亞健康干預(yù)技術(shù)實(shí)驗(yàn)室糖尿病干預(yù)中心研究成果。他指出，糖尿病中醫(yī)營養(yǎng)干預(yù)技術(shù)就是以三低三高(低血糖負(fù)荷、低卡路里、低碳水化合物和高不飽和脂肪酸、高膳食纖維、高藥食同源)的飲食模式和間歇性禁食方式治療糖尿病，以科學(xué)的方法為導(dǎo)向，重點(diǎn)教會糖尿病病人正確的健康生活方式，教會他們自我管理血糖的方法，逐步實(shí)現(xiàn)恢復(fù)胰島功能，重新奪回控制血糖的主動(dòng)權(quán)，幫助廣大糖尿病患者控制病情發(fā)展的問題，有利于糖尿病患者科學(xué)的自我管理，達(dá)到改善健康狀況或治療疾病的目標(biāo)。

以下是劉東波教授的文獻(xiàn)：

GLP1R-GFP

胡涌泉 1，2 ，曾璐漫 2，6 ，吳艷陽 2，5 ，魏云林 7 ，劉東波 1，2，3，4*

(1. 湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝園林學(xué)院，長沙　410128;2. 國家中醫(yī)藥管理局亞健康干預(yù)技術(shù)實(shí)驗(yàn)室，長沙　410128;3. 湖南省作物種質(zhì)創(chuàng)新與資源利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，長沙　410128;4.湖南省植物功能成分利用協(xié)同創(chuàng)新中心，長沙410128;5. 湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)技術(shù)學(xué)院，長沙　410128;6. 湖南應(yīng)用技術(shù)學(xué)院，湖南　常德415100;7. 昆明理工大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，昆明　650500)摘要：目的　本研究目的是構(gòu)建一種能穩(wěn)定表達(dá)綠色熒光蛋白(GFP)人胰高血糖素樣肽 -1 受體(GLP1R)的胰島細(xì)胞系，用來篩選 GLP1R 激動(dòng)劑類藥物。方法　使用 X-tremeGENE HP DNATransfection Reagent將 pCMV6-AC-GLP1R-GFP 質(zhì)粒轉(zhuǎn)染到 Rin-m5F細(xì)胞，經(jīng) G418 篩選單克隆 Rin-m5F/GLP1R-GFP 細(xì)胞并擴(kuò)大培養(yǎng)。結(jié)果　該細(xì)胞能穩(wěn)定傳代，熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞綠色熒光分布均勻，Western blot驗(yàn)證 GLP1R 蛋白表達(dá)顯著增加。在實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證中，對照空白組中細(xì)胞綠色熒光分布均勻，陰性藥物格列本脲(非 GLP1R 靶點(diǎn)藥物)作用時(shí)細(xì)胞內(nèi)無明顯熒光斑點(diǎn)出現(xiàn)，陽性藥物百泌達(dá)作用(GLP1R 激動(dòng)劑類藥物)時(shí)細(xì)胞內(nèi)出現(xiàn)顯著熒光斑點(diǎn)。結(jié)論　GLP1R 激動(dòng)劑類藥物篩選模型 Rin-m5F/GLP1R-GFP 成功構(gòu)建。該模型能對混合物樣品進(jìn)行篩選，具有假陽性極低、篩選所需樣本小、篩選樣品量大、易標(biāo)準(zhǔn)化、篩選速度快、特異性強(qiáng)等優(yōu)勢，為 GLP1R 激動(dòng)劑類藥物的篩選奠定了基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞：人胰高血糖素樣肽 -1 受體;Rin-m5F;質(zhì)粒轉(zhuǎn)染

中圖分類號：R739.4　　　　文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A　　　　文章編號： 1672-2981(2017)06-0785-05doi:10.7539/j.issn.1672-2981.2017.06.018Construction of GLP1R-GFP stably transfection Rin-m5F cell linesHU Yong-quan 1, 2 , ZENG Lu-man 2, 6 , WU Yan-yang 2, 5 , WEI Yun-lin 7 , LIU Dong-bo 1, 2, 3, 4* (1. Horticulture andLandscape College, Hunan Agricultural University, Changsha 410128; 2.State Key Laboratory of SubhealthIntervention Technology, Changsha410128; 3. Hunan Key Laboratory of Crop Germplasm Innovation andUtilization, Hunan Agricultural University, Changsha 410128; 4. Hunan Co-Innovation Center forUtilizationof Botanical Functional Ingredients, Changsha 410128; 5. College of Food Science and Technology, HunanAgricultural University, Changsha 410128; 6. Hunan College of Applied Technology, Changde Hunan 415100;7. Faculty of Life Sciences and Technology, Kunming University of Science and Technology, Kunming 650500)Abstract: Objective To establish a new method to screen glucagon like peptide-1 receptor (GLP1R) agonists.Methods The pCMV6-AC-GLP1R-GFP plasmid was transfected into Rin-m5F cells byX-tremeGENE HPDNA transfection reagent. Monoclonal Rin-m5F/GLP1R-GFP cells were screened by G418. The fluorescencespots were observed by fluorescence microscope. GLP1R expression was de tected by Western blot. ResultsThese cells were passaged normally with stable green fluorescence, and the expression of GLP1R protein wassignificantly increased. The green fluorescence of the control group was dispersive, and the Glibenclamide

(non GLP1R target drugs) treatment group did not show distinct fluorescence spots, while the Byetta (GLP1Ragonists) treatment group showed lots of fluorescence spots (activation of GLP1R). Conclusion Rin-m5F/GL-P1R-GFP, the model for GLP1R agonist screening, has been successfully constructed. This model is rapid and基金項(xiàng)目：國際科技合作與交流專項(xiàng)(No.2013DFG32060)。

作者簡介：胡涌泉，男，在讀碩士研究生，主要從事細(xì)胞生物學(xué)、分子營養(yǎng)研究，E-mail：bookhulai@sina.cn　 * 通訊作者：劉東波，男，教授，博士研究生導(dǎo)師，主要從事亞健康干預(yù)基礎(chǔ)和應(yīng)用技術(shù)研究，Tel：(073184617244，E-mail：chinasaga@163.com786Central South Pharmacy. June 2017, Vol. 15 No.6　中南藥學(xué) 2017 年 6 月 第 15 卷 第 6 期糖尿病是由遺傳因素、病毒感染、自由基毒素、細(xì)胞因子等各種致病因子作用于機(jī)體導(dǎo)致胰島功能減退，肝臟、骨骼肌、脂肪組織等發(fā)生胰島素抵抗進(jìn)而引發(fā)的一系列代謝紊亂綜合征[1-4] 。臨床上以高血糖(空腹血糖> 7.0 mmol·L- 1 ，餐后血糖> 11.1mmol·L- 1 )為主要特點(diǎn) [5] 。糖尿病患者組織器官長期處于高血糖狀態(tài)會引發(fā)諸多并發(fā)癥，導(dǎo)致心腦血管、肝、腎眼、足等部位的衰竭病變，且無法治愈[6-8] 。胰 高 血 糖 素 樣 肽 1(GLP1) 因 與 GLP1 受 體(GLP1R)結(jié)合后可刺激胰島素分泌并抑制胰高血糖素分泌，已成為近些年糖尿病藥物開發(fā)的重要靶點(diǎn)[9] 。已有的 GLPlR 激動(dòng)劑類藥物均屬于大分子多肽類，不能口服給藥，長期服用會產(chǎn)生諸多不良反應(yīng)，且保存與運(yùn)輸條件要求嚴(yán)苛[10-11] 。因此需要尋找不良反應(yīng)少且療效長期穩(wěn)定的 GLP1R 小分子激動(dòng)劑藥物。目前基于 GLPlR 為靶點(diǎn)構(gòu)建的高通量 GLP1 激動(dòng)劑篩選模型主要從受體與配體結(jié)合、檢測胞內(nèi)第二信使 cAMP、構(gòu)建受體功能反應(yīng)報(bào)告基因三個(gè)方面進(jìn)行[12] 。但這些篩選模式假陽性高、篩選時(shí)間長、篩選效低，嚴(yán)重制約了 GLP1 類似物小分子藥物的開發(fā)。因此建立篩選 GLPlR 激動(dòng)劑模的研究變得尤為迫切。本文研究目的是建立一種新的 GLPlR 激動(dòng)劑類藥物篩選方法：構(gòu)建穩(wěn)定表達(dá)綠色熒光蛋白人 GLP1R 細(xì)胞模型 Rin-m5F/GLP1R-GFP并通過陽性藥物百泌達(dá)、陰性藥物格列本脲驗(yàn)證該模型應(yīng)用于 GLPlR 激動(dòng)劑類物篩選的效果。

1

1.1

株大鼠胰島素瘤細(xì)胞株(Rin-m5F)(上海通派生物科技有限公司)。

1.2

pCMV6-AC-GLP1R-GFP質(zhì)粒(湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)劉東波教授惠贈)，RMPI 1640 培養(yǎng)基(Gibco)，胎牛血清(BI)，谷氨酰胺(TransGen)，0.25%EDTA- 胰酶(TransGen)，X-tremeGENE HP DNA TransfectionReagent(Roche)G418(Sigma)，防熒光淬滅封片劑(Southern Biotech)，多聚甲醛(Sigma)，GLP1R抗體(Abcam)，GAPDH 抗體(Yataihengxin)，羊抗小鼠 IgG1 二抗(Southern Biotech)，羊抗兔 IgG1 二抗，一次性過濾器(Millex)，一次性注射器(上海治宇)，圓形蓋玻片、載玻片(世泰)，細(xì)胞培養(yǎng)板(Corning)等。

1.3

CO 2恒溫細(xì)胞培養(yǎng)箱(美國 SHELLAB)，倒置顯

微鏡(上海荼明光學(xué) BXP-106)，倒置熒光顯微鏡(日本 OLYMPUS)，激光共聚焦熒光顯微鏡(Zeiss LSM710)，超凈工作臺(蘇州凈化設(shè)備有限公司，SW-CJ-IFD)，Countess 自動(dòng)細(xì)胞計(jì)數(shù)儀(Life Technologies)，電子天平(型號 JL3003，JENNER)，超純水儀(Milli-RO Plus，millipore)等。

2

2.1

細(xì)胞復(fù)蘇后置于 25 cm 2 培養(yǎng)瓶中，在 37℃，5%CO 2 條件下培養(yǎng)，具體方法見參考文獻(xiàn)[13] 。

2.2

①取對數(shù)生長期 Rin-m5F細(xì)胞消化成單個(gè)的細(xì)

胞懸液，均勻接種于 6 孔板中，設(shè)置細(xì)胞密度分別為2×10 5 、4×10 5 個(gè)·mL- 1 ，CO2 培養(yǎng)箱過夜培養(yǎng);

②根據(jù)轉(zhuǎn)染試劑說明書上推薦的使用濃度制備轉(zhuǎn)染溶液，質(zhì)粒(μg)∶轉(zhuǎn)染試劑(μL)分別為 1∶2、1∶3、1∶4。取 2.5 μg pCMV6-AC-GLP1R-GFP 質(zhì) 粒 溶 于 97 μL無血清 RMPI 1640 培養(yǎng)基中，輕輕來回混勻，室溫靜置5 min，使質(zhì)粒與培養(yǎng)基充分混勻;再按照比例相應(yīng)加入轉(zhuǎn)染試劑，輕輕來回混勻，室溫靜置 40 min，使混合物充分混勻;

③棄掉 6 孔板中的培養(yǎng)基，用 PBS 洗2 遍，每孔加入 2 mL新鮮完全培養(yǎng)基;

④在轉(zhuǎn)染組逐滴加入轉(zhuǎn)染溶液，邊加邊晃動(dòng) 6 孔板，使轉(zhuǎn)染液與細(xì)胞培養(yǎng)基充分混勻。

⑤標(biāo)記好空白組及對照組，將細(xì)胞放入 CO 2 細(xì)胞培養(yǎng)箱中，37℃、5%CO 2 培養(yǎng)24 h;

⑥倒置熒光顯微鏡下觀察，隨機(jī)選取視野并拍照。運(yùn)用軟件 Image-Pro-Plus 6.0 統(tǒng)計(jì)細(xì)胞數(shù)目，計(jì)算轉(zhuǎn)染效率;

⑦去掉轉(zhuǎn)染溶液，PBS 洗 2 遍，加入新鮮完全培養(yǎng)基恢復(fù)培養(yǎng) 2 d，備用。

2.3

①取對數(shù)生長期 Rin-m5F細(xì)胞消化成單個(gè)的細(xì)胞懸液，均勻接種于 24 孔板中，過夜培養(yǎng)。

② PBS洗2 遍，更換新鮮培養(yǎng)基，按下面濃度加入 G418 溶液：1000、600、200、100、50、0 μg·mL -1 。

③按照步驟②中 G418 濃度梯度，每 2 日更換 1 次新鮮培養(yǎng)基(含 G418)，連續(xù)培養(yǎng)觀察 14 d。若孔內(nèi)細(xì)胞大量死亡，則該孔 G418 減半篩選;若孔內(nèi)細(xì)胞已全部死亡，則該孔停止加入 G418 溶液。每日在倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞死亡情況。

④將“2.2”項(xiàng)下恢復(fù)培養(yǎng) 2 d 后轉(zhuǎn)染組的細(xì)胞，加入 1 mg·mL -1 G418 溶液培養(yǎng) 2 d，PBS 洗 2 遍，更換新鮮培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)，每日觀察細(xì)胞生長情況。

2.4

①按照“2.2”項(xiàng)下最佳轉(zhuǎn)染體系轉(zhuǎn)染細(xì)胞，24 hefficient for screening GLP1R agonists, owint to its advantage of admixture-screening, high throughput, lowfalse positive rate, fewer samples needed and ease of application comparing to the traditional screening model.Key words: glucagon like peptide-1 receptor; Rin-m5F; plasmid transfection787

中南藥學(xué) 2017 年 6 月 第 15 卷 第 6 期　Central South Pharmacy. June 2017, Vol. 15 No.6后去轉(zhuǎn)染液，PBS 洗 2 遍，更新 2 mL新鮮培養(yǎng)基，37℃、5%CO 2 恢復(fù)培養(yǎng) 2 d。

②加入 G418，篩選轉(zhuǎn)染細(xì)胞。按“2.3”項(xiàng)下篩選得到的 G418 濃度，先選用使細(xì)胞大量死亡的濃度，然后更換小濃度 G418 繼續(xù)篩選。

③每日在倒置熒光顯微鏡下觀察，當(dāng)轉(zhuǎn)染組中未被轉(zhuǎn)染的細(xì)胞全部被殺死，則停止 G418 篩選。

④PBS洗 2 遍，更換新鮮培養(yǎng)基，37℃、5%CO 2 培養(yǎng)，至綠色熒光細(xì)胞出現(xiàn)單克隆團(tuán)細(xì)胞。期間根據(jù)培養(yǎng)基顏色及細(xì)胞狀態(tài)及時(shí)更換新鮮完全培養(yǎng)基。

⑤采用梯度稀釋法篩選單克隆細(xì)胞株：將轉(zhuǎn)染組中孔內(nèi)的細(xì)胞用胰酶消化，棄掉胰酶，加入 1 mL新鮮完全培養(yǎng)基將細(xì)胞吹打成單個(gè)的細(xì)胞懸液。按照 10 倍稀釋法，將細(xì)胞加入 96 孔板中依次進(jìn)行稀釋，直至孔內(nèi)細(xì)胞濃度為 1 ～ 2 個(gè)每 100 μL。

⑥每日置于倒置熒光顯微鏡下觀察，根據(jù)實(shí)際情況為細(xì)胞更換新鮮完全培養(yǎng)基。

⑦當(dāng) 96 孔板內(nèi)細(xì)胞密度達(dá)到 30%時(shí)，消化細(xì)胞移入 24孔內(nèi)擴(kuò)大培養(yǎng)。

⑧當(dāng) 24 孔板內(nèi)細(xì)胞密度達(dá)到 80%以上時(shí)，消化細(xì)胞移入 T-25 細(xì)胞培養(yǎng)瓶中擴(kuò)大培養(yǎng)。

⑨凍存細(xì)胞，備用。

2.5

在 6 孔板內(nèi)分別接種相同數(shù)目的 Rin-m5F野生型細(xì)胞和步驟“2.4”項(xiàng)下獲得的Rin-m5F/GLP1R-GFP單克隆細(xì)胞株，在完全培養(yǎng)液中培養(yǎng)至細(xì)胞密度長至90%左右。PBS 洗 2 遍，每孔加 200 μL2%SDS 裂解液，收取蛋白樣品。置于 100℃水浴 10 min，加入 40μL的 6× 上樣 Buffer稀釋，置于 100℃水浴 10 min。Western blot實(shí)驗(yàn)方法見參考文獻(xiàn)[14] 。

2.6

實(shí)驗(yàn)分為空白對照(完全培養(yǎng)基)、溶劑對照(培養(yǎng)基加入 1%PBS、1%酒精、1%DMSO)、陽性對照(GLP1R 靶點(diǎn)藥劑，百泌達(dá))、陰性對照(非 GLP1R靶點(diǎn)藥劑，格列本脲)。不同濃度藥物處理相同時(shí)間：濃度設(shè)置為 0.25、0.5、2.5、5 μg·mL- 1 ，均處理 1 h。相同濃度藥物處理不同時(shí)間：藥物濃度為 0.25μg·mL- 1 ，分別處理 10、20、40、120 min。

操作流程：

①將無菌圓形玻片在酒精燈火焰上來回灼燒數(shù)次，冷卻后平鋪在 24 孔板內(nèi)，每孔一片;

②取“2.4”項(xiàng)下獲得的單克隆細(xì)胞 Rin-m5F/GLP1R-GFP接種于圓形玻片上，輕輕搖晃培養(yǎng)板，使細(xì)胞均勻分布在板內(nèi)，過夜至細(xì)胞密度長至 85%以上;

③ PBS洗2 遍，加入含不同濃度藥物的培養(yǎng)基 37℃孵育不同時(shí)間;

④吸棄培養(yǎng)液，PBS 洗 3 遍。加入 500 μL 4%多聚甲醛固定細(xì)胞 10 min，吸棄，PBS 洗 3 遍;

⑤取潔凈載玻片，滴加 20 μL防熒光淬滅粘片劑，用鑷子輕輕夾起圓形玻片，輕輕倒扣在防熒光淬滅粘片劑上，防止氣泡產(chǎn)生;

⑥將玻片置于暗室通風(fēng)干燥過夜，制好的玻片于激光共聚焦熒光顯微鏡下觀察并拍照。

2.7

采用 SPSS 17.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。數(shù)據(jù)以均數(shù) ± 標(biāo)準(zhǔn)差(x±s)表示，組間采用單因素方差分析，各組均數(shù)都采用 LSD(Least-significant differencetest)檢測，若 P < 0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3

3.1

細(xì)胞 Rin-m5F復(fù)蘇時(shí)在顯微鏡下觀察，細(xì)胞基本呈單個(gè)、圓形均勻分布在新鮮完全培養(yǎng)基內(nèi)，細(xì)胞密度為 50%左右，培養(yǎng)基中無明顯雜質(zhì)。過夜培養(yǎng)后，細(xì)胞貼壁率為 90%以上，細(xì)胞輪廓清晰、多呈不規(guī)則形狀分布，多呈島狀聚集鋪開生長。經(jīng)胰酶消化，顯微鏡下觀察顯示細(xì)胞逐漸變圓，細(xì)胞間開始出現(xiàn)間隙。吹打成單個(gè)以 1∶3 傳代至 3 代時(shí)，細(xì)胞形態(tài)正常、生長速率恢復(fù)到最佳，每 2 ～ 3 日即可傳代(見圖 1)。

圖 1　Rin-m5F細(xì)胞顯微鏡觀察圖(200×)

Fig 1　Micro-observation of Rin-m5F cell lines(200×)

3.2

轉(zhuǎn)染時(shí)在細(xì)胞接種量、質(zhì)粒∶轉(zhuǎn)染試劑 2 個(gè)方面進(jìn)行優(yōu)化，轉(zhuǎn)染 24 h 后，倒置熒光顯微鏡下觀察轉(zhuǎn)染成功的細(xì)胞整個(gè)分布綠色熒光、熒光強(qiáng)度不一。拍照、統(tǒng)計(jì)轉(zhuǎn)染效率分別見表 1。

表 1　轉(zhuǎn)染效率Tab 1　Transfection efficiency

3.3

加入各濃度 G418 培養(yǎng)細(xì)胞，每日在倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞生長狀態(tài)。觀察得到 10 ～ 14 d 最低濃度至全部細(xì)胞死亡的 G418 濃度為 100 μg·mL -1 。但是Rin-m5F細(xì)胞在 G418 作用 48 h 后，濃度 1 mg·mL -1組的細(xì)胞基本全部死亡。Rin-m5F細(xì)胞轉(zhuǎn)染組在 1788Central South Pharmacy. June 2017, Vol. 15No.6　中南藥學(xué) 2017 年 6 月 第 15 卷 第 6 期mg·mL -1 G418 中培養(yǎng) 48 h 后，未轉(zhuǎn)染的細(xì)胞大量死亡，轉(zhuǎn)染成功帶綠色熒光的細(xì)胞形態(tài)無顯著變化，繼續(xù)培養(yǎng)，帶綠色熒光的細(xì)胞開始分裂增殖(見圖 2)。

圖 2　熒光顯微鏡細(xì)胞觀察圖(scale bar= 100 μm)

Fig 2　Fluorescence microscope-observation ofcells(scale bar = 100μm)

3.4

Rin-m5F細(xì)胞孵育轉(zhuǎn)染溶液 24 h、更換新鮮完全培養(yǎng)基恢復(fù)培養(yǎng) 24 h、1 mg·mL -1 濃度的 G418 篩選培養(yǎng) 2 d 后，倒置熒光顯微鏡下觀察未被轉(zhuǎn)染的細(xì)胞基本全部死亡。降低 G418 濃度至 100 μg·mL -1 ，每3 日更換 1 次新鮮完全培養(yǎng)基，成功轉(zhuǎn)染的細(xì)胞擴(kuò)大培養(yǎng) 12 d，按照 10 倍稀釋法消化細(xì)胞接種于 96 孔板，選取熒光強(qiáng)、分布均勻的單克隆細(xì)胞并擴(kuò)大培養(yǎng)，倒置熒光顯微鏡和激光共聚焦顯微鏡下觀察、拍照，結(jié)果見圖 3。

圖 3　Rin-m5F/ GLP1RGFP 單 克 隆 細(xì) 胞 觀 察 圖(scale bar= 200μm、10 μm)

Fig 3　Observation ofRin-m5F/ GLP1R-GFP monoclonal cells(scalebar= 200 μm、10 μm)

3.5

以 Rin-m5F為空白對照，53 KD 處轉(zhuǎn)染后獲得的單克隆細(xì)胞株 Rin-m5F/GLP1R- GFP 中 GLP1R 表達(dá)量增加，結(jié)果見圖 4。結(jié)果表明：GLP1R 已成功轉(zhuǎn)染，并在單克隆細(xì)胞中穩(wěn)定表達(dá)。

圖 4　GLP1R 的表達(dá)

Fig 4　Expression of GLP1R

3.6

單克隆細(xì)胞株 Rin-m5F/GLP1R-GFP 在不同條件下孵育，收樣、制片，置于激光共聚焦下觀察并拍照，結(jié)果見圖 5 ～ 6。如圖所見，溶劑對照組中細(xì)胞綠色熒光均勻分布，陰性對照組(非 GLPlR 靶點(diǎn)藥物)中無明顯熒光斑點(diǎn)，陽性對照組(GLPlR 激動(dòng)劑藥物)中細(xì)胞內(nèi)出現(xiàn)明顯的熒光斑點(diǎn)。

圖 5　不同濃度藥物處理細(xì)胞 1 h 結(jié)果(scale bar= 10 μm)Fig 5　Cells treated with different concentrations of drugs for 1 h(scalebar= 10 μm)

圖 6　相同濃度藥物處理細(xì)胞不同時(shí)間結(jié)果(scale bar= 10 μm)

Fig 6　Confocal fluorescence microscopy of cells(scale bar= 10 μm)

結(jié)果表明：綠色熒光標(biāo)記的 GLPlR已經(jīng)成功整合到 Rin-m5F中，并穩(wěn)定表達(dá)。非 GLPlR靶點(diǎn)藥物格列本脲處理組細(xì)胞內(nèi)無明顯熒光斑點(diǎn)，未能激活模型;GLPlR激動(dòng)劑藥物百泌達(dá)處理組細(xì)胞內(nèi)綠色熒光明顯聚集成熒光斑點(diǎn)，激活模型。因此該模型建立成功，能用于篩選 GLPlR激動(dòng)劑類藥物。

4

目前大部分以 GLPlR為靶點(diǎn)構(gòu)建的高通量激動(dòng)劑篩選模型的設(shè)計(jì)原理是根據(jù) GLPlR信號途徑的特點(diǎn)來設(shè)計(jì)，主要可以分為以下 3 個(gè)方面[15] ：① 基于受體與配體結(jié)合原理構(gòu)建模型：熒光微體積測定技術(shù)、熒光偏振法;② 基于檢測胞內(nèi)第二信使 cAMP構(gòu)建模型：競爭性酶聯(lián)免疫吸附檢測法、閃爍鄰近測定法、載黑色素細(xì)胞測定法;③ 基于受體功能反應(yīng)構(gòu)建報(bào)告基因構(gòu)建模型：陳家琪等[16]在 CHO細(xì)胞中穩(wěn)定轉(zhuǎn)染帶有增強(qiáng)型789中南藥學(xué) 2017 年 6 月 第 15 卷 第6 期　Central South Pharmacy. June 2017, Vol. 15 No.6綠色熒光蛋白(EGFP)報(bào)告基因和 GLP1R，殷菲等[17]利用 GLPlR和報(bào)告基因在 PC12 細(xì)胞中建立穩(wěn)定的GLPlR激動(dòng)劑篩選模型。這 3 個(gè)方面設(shè)計(jì)的篩選模型各有特色，受體——配體結(jié)合分析檢測方法缺點(diǎn)是成本高且不能識別是配體是激動(dòng)還是拮抗劑;檢測 cAMP的篩選模型要求裂解細(xì)胞釋放出胞內(nèi)的 cAMP，且還需洗滌除去未結(jié)合的標(biāo)記 cAMP;報(bào)告基因篩選模型常需要作用底物或者輔助因子，篩選成本高。本實(shí)驗(yàn)中選用 Rin-m5F作為宿主細(xì)胞是基于GLPlR 激動(dòng)劑類藥物治療糖尿病的主要作用靶點(diǎn)位于胰島細(xì)胞上，這樣筆者的篩選模型能更加貼切反應(yīng)藥物治療糖尿病時(shí)的生理機(jī)能。采用直接標(biāo)記 GLPlR C端，使靶蛋白可視化，通過觀察胞內(nèi)熒光變化就能直觀反應(yīng)受體被激活，具有極大降低假陽性的優(yōu)勢。高內(nèi)涵篩選平臺是近年發(fā)展起來的新的篩選模式，通過采集熒光圖像，綜合運(yùn)用高分辨率的熒光數(shù)碼影像技術(shù)、數(shù)理統(tǒng)計(jì)分析方法等模板在單一實(shí)驗(yàn)中反應(yīng)被測樣品的生物活性、藥代動(dòng)力學(xué)性質(zhì)和潛在毒性等。該篩選技術(shù)的優(yōu)勢在于所有的檢測能在活細(xì)胞內(nèi)進(jìn)行，篩選速度快。本文建立的基于熒光標(biāo)記使靶向蛋白可視化的原理，使該模型符合高內(nèi)涵篩選平臺的基本要求，為篩選 GLPlR 激動(dòng)劑的高通量篩選奠定了堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。該模型能應(yīng)用于混合物樣品 GLP1 類似物小分子藥物的篩選，具有假陽性極低、篩選所需樣本小、篩選樣品量大、易標(biāo)準(zhǔn)化、篩選速度快、特異性強(qiáng)等優(yōu)勢。同時(shí)這種研究模式為我國中藥分子機(jī)制提供新的思路，為我國中藥實(shí)現(xiàn)復(fù)方創(chuàng)新、早期評價(jià)、早期淘汰等目標(biāo)提供便捷。參考文獻(xiàn)[1] 中華醫(yī)學(xué)會糖尿病學(xué)分會 . 中國 2 型糖尿病防治指南(2007 年版)[J]. 中華醫(yī)學(xué)雜志，2008，88(18)：1227-1245.[2] LiuD，Darville M，Eizirik DL. Double-stranded ribonu-cleic acid(RNA)induces beta-cell Fas messenger RNAexpression and increases cytokine-induced beta-cell apopto-sis [J]. Endocrinology，2001，142(6)：2593-2599.[3] Liu D，Pavlovic D，Chen MC，et al. Cytokines induceapoptosis in beta-cells isolated from mice lacking the induc-ible isoform of nitric oxide synthase(iNOS-/-)[J]. Diabe-tes，2000，49(7)：1116-1122.[4] Muoio DM，Newgard CB. Mechanisms of disease：Mo-lecular and metabolic mechanisms of insulin resistance andbeta-cell failure in type 2 diabetes [J]. Nat Rev Mol CellBiol，2008，9(3)：193-205.[5] 錢榮立 . 關(guān)于糖尿病的新診斷標(biāo)準(zhǔn)與分型[J]. 中國糖尿病雜志，2000，8(1)：5-6.[6] 姚君厘，楊永年 . 糖尿病并發(fā)癥感染及其危險(xiǎn)因素分析[J]. 中華醫(yī)院感染學(xué)雜志，1998，8(4)：216-218.[7] Bahtiyar G，Gutterman D，Lebovitz H. Heart failure：amajor cardiovascular complication of diabetes mellitus [J].Current Diabetes Reports，2016，16(11)：116-130.[8] Bril F，Cusi K. Nonalcoholic fatty liver disease：The newcomplication of type 2 diabetes mellitus [J]. Endocrinol Me-tab Clin North Am，2016，45(4)：765-781.[9] Bo AE. Islet G protein-coupled receptors as potential targetsfor treatment of type 2 diabetes [J]. Nature Reviews DrugDiscovery，2009，8(5)：369-385.[10] 閆榮，楊子義 . 胰高血糖素樣肽 -1 類似物新藥的研發(fā)進(jìn)展[J]. 中國生物制品學(xué)雜志，2011，24(7)：866-868.[11] 毛黎靜，安春紅，張貝娜，等 . 新型糖尿病治療藥物的研究進(jìn)展[J]. 中南藥學(xué)，2017，15(1)：88-91.[12] 盛靈通，孔建龍，秦健，等 . GLP-1 及其類似物治療糖尿病的研究進(jìn)展[J]. 糖尿病新世界，2015，(2)：22-23.[13] Lai X，Kang X，Zeng L，et al. The protective effectsand genetic pathways of thorn grape seeds oil against highglucose-induced apoptosis in pancreatic β -cells [J]. BMCComplem Altern M，2014，14(1)：10-17.[14] Wu Y，Wang X，Guo H，et al. Synthesis and screeningof 3-MA derivatives for autophagy inhibitors. [J]. Autopha-gy，2013，9(4)：595-603.[15] 許芳芳，王楠，李剛強(qiáng)，等 . 人胰高血糖素樣肽 -1 的研究與應(yīng)用進(jìn)展[J]. 生物技術(shù)通報(bào)，2016，32(6)：30-37.[16] 陳家琪，高智慧，朱元元，等 . 重組胰高血糖素樣肽 -1與人血清白蛋白融合蛋白的純及活性研究[J]. 微生物學(xué)通報(bào)，2007，34(5)：871-874.[17] 殷菲，鄧小紅，景佳佳，等 . 胰高血糖素樣肽 1 受體激動(dòng)的高通量篩選及作用機(jī)制研究[J]. 中國藥學(xué)雜志，2007，42(1)：24-27.

（收稿日期：2017-02-20；修回日期：2017-05-01）

(新媒體責(zé)編：syhz0808)